HPV e Diagnóstico

HPV e Classificação e Genotipagem

Os vários tipos e subtipos são classificados, de acordo com a semelhança na seqüência dos nucleotídeos, por meio de técnicas de hibridização molecular. Quando há menos que 50% de semelhança com outros membros, é definido um novo tipo e atribui-se um novo número, na ordem da descoberta. Se a semelhança for maior que 50%, caracteriza-se um novo subtipo e, se próxima de 100%, os vírus são considerados variantes do mesmo tipo. Assim, os HPV são genotipados e não sorotipados.

Um dos maiores problemas para a caracterização e subtipagem dos vírus é a inexistência de cultura celular específica e de um modelo animal suscetível ao HPV. Portanto, seu diagnóstico é feito a partir de informações da estrutura viral e da sua interação com a celula.

Atualmente, mais de 150 tipos são reconhecidos, e a importância clínica disso deve-se ao fato de que tipos diferentes têm sítios de infecção distintos, podendo ser, assim, separados em vírus cutâneos e mucosotrópicos.
Mais de 35 tipos de HPV infectam a região anogenital nos seres humanos e podem causar desde as clássicas verrugas genitais ou condilomas até lesões displásicas de baixo e alto grau, dos quais cerca de 20 deles estão associados com câncer de colo uterino. Os tipos de HPV podem ser separados em vírus de baixo, intermediário ou alto risco, de acordo com o tipo de lesão a que estão mais associados. Os HPV dos subtipos 6, 11, 41, 42, 43 e 44 estão geralmente associados a infecções benignas do trato genital, como o condiloma acuminado ou plano, e estão presentes na maioria das infecções clinicamente aparentes causadas pelo vírus. Normalmente, esses tipos não estão associados a displasias quando examinados pela histopatologia.

Cada tipo viral apresenta maior ou menor potencial oncogênico, sendo encontrado com maior frequência em lesões benignas (vírus de baixo risco) ou em lesões neoplásicas (vírus de alto risco).

Tipos e Subtipos do Vírus do HPV

Inúmeros trabalhos encontrados na literatura mundial enfatizam a dificuldade de realizar um diagnóstico preciso de HPV. Hoje está claro que não existe um exame único isolado que permita o diagnóstico de certeza.

A peniscopia, vulvoscopia, vaginoscopia, colposcopia localizam lesões suspeitas; não temos certeza de que aquelas alterações encontradas são causadas pelo HPV.

Quando encaminhamos o material para histologia, podemos evidenciar alterações que sugerem a presença do vírus; também não é certeza que existe a infecção, porém esse exame é importante para fazer o diagnóstico diferencial com outras doenças. E, finalmente, hoje podemos contar com testes de biologia molecular que identificam a presença do vírus evidenciando o seu DNA. Dessa maneira, precisamos localizar lesões suspeitas e nelas pesquisarmos a presença do vírus.

A sensibilidade de um método consiste na identificação dos pacientes possivelmente infectados. Quanto mais sensível for o método, maior possibilidade de definir a infecção. Isso não significa que esses pacientes estejam infectados.

Por isso, o método tem de ter alta especificidade, ou seja, deve permitir distinguir, entre os pacientes suspeitos, aqueles que não têm a infecção. A peniscopia tem alta sensibilidade e os métodos de biologia molecular, alta especificidade.

GENITOSCOPIA

A genitoscopia consiste no exame da região genital masculina que inclui: pênis, uretra, escroto, pube, região inguinal e região perineal.

Peniscopia

A realização da peniscopia segue três tempos:

1º tempo: Exame do pênis a olho nu, pesquisando-se condilomas acuminados, por vezes minúsculos, e pápulas cor da pele, transparentes, vermelhas, róseas, leucoplásicas ou pigmentadas.


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Foto exame físico

2º tempo: O pênis é envolto com gaze embebida em ácido acético a 5%, cobrindo a sua superfície e elevando o prepúcio, já que a sua parte interna é o local mais acometido.


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Fotos ácido acético

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Lesão acetopositiva

3º tempo: São realizadas biópsias, nas lesões clínicas e subclínicas, e o material colhido é encaminhado para histologia e pesquisa do DNA viral.

A peniscopia tornou-se um método muito importante para localizar as lesões suspeitas de estarem infectadas pelo HPV, por permitir o diagnóstico de lesões subclínicas no homem assintomático.

Hoje utilizamos a videopeniscopia, que consiste em realizar a peniscopia acompanhada por um sistema de vídeo, que possibilita o acompanhamento do exame pelo paciente e a documentação do exame.


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Foto lesão verrucosa

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Videopeniscopia Dr. Julio Carvalho

Acredito que a melhor maneira de se realizar uma peniscopia é com o paciente em posição ginecológica, devido a vários motivos, tais como:

- paciente fica imóvel;
- permite a visualização da região inguinal, perianal e perineal;
- facilita a coleta de exame;
- facilidade da realização do tratamento.

Uretroscopia


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Lesão na uretra

Consiste no exame da uretra. A uretra pode ser um reservatório para o HPV, e a infecção ocorre geralmente na uretra distal. É um exame simples, pouco agressivo e de grande utilidade, principalmente nos casos que apresentam recidiva freqüente.

Oroscopia

O exame da cavidade oral é fundamental, principalmente quando o paciente pratica o sexo oral, ou quando a recidiva é freqüente. Geralmente são encontradas na região lateral da língua, freio sublingual e gengiva.

Anuscopia/Retoscopia

Consiste na avaliação da região perianal, anal e retal. Inicialmente são localizadas as lesões visíveis, e as lesões menores podem ser localizadas utilizando-se o colposcópio e o anuscópio. Podem ser utilizados o ácido acético e o azul de toluidina para a localização de lesões nas regiões cutâneas. Essa avaliação é de suma importância, uma vez que a incidência nessa região aumenta nos casos em que é comum a prática do sexo anal.

Biópsia dirigida

Consiste na coleta de material nas lesões suspeitas de HPV. Essas regiões podem ser verrugas visíveis ou lesões subclínicas no genital masculino ou feminino. Esse procedimento é realizado com anestesia local, e na sua grande maioria o tratamento já é realizado ao mesmo tempo (cauterização química, por eletrocautério ou por laser).


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Foto biópsia dirigida

No colo uterino utiliza-se a pinça de Gaylor-Medina. No pênis utilizamos a pinça de JCarvalho, que foi desenvolvida para esse fim, com o intuito de colher lesões microscópicas causando o mínimo de lesão. Essa pinça permite a coleta de material suficiente para exame com o mínimo de lesão, proporcionando cicatrizes penianas imperceptíveis.


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Pinça JCarvalho

HPV e Colposcopia

A colposcopia consiste em exame de avaliação visual do trato genital inferior feminino utilizando equipamento com lentes (colposcópio) que permite ampliação da região e reconhecimento das áreas normais e das áreas acometidas pelo HPV.
Inicialmente é realizada visualização de toda região genital feminina (vulva, vagina e colo uterino) e constatada ou não a presença de verrugas, em seguida é colocada gaze embebida em ácido acético na região vulvar e vaginal e reavaliação visual para localizar lesões aceto positivas sugestivas de infecção pelo HPV.
Essas lesões encontradas são submetidas a biópsia e o material colhido é encaminhado para exame histológico e/ou para exames de biologia molecular (PCR, captura híbrida, ou hibridização in situ).
É realizada aplicação de lugol (iodo) na região do colo uterino e da vagina (Teste de Schiller) e avaliação com o colposcópio para observar áreas iodo negativas indicando as regiões que apresentam alterações epiteliais (regiões que não produz glicogênio).
Além da avaliação diagnóstica a colposcopia permite o tratamento das lesões encontradas através de cauterizações com bisturi elétrico ou laser de CO2.

HPV e Diagnóstico Diferencial

O estudo histológico, além de identificar as alterações histológicas sugestivas de infecção pelo HPV, possibilita diagnosticar outras lesões que podem vir associadas ou isoladas ao HPV e que fazem parte do diagnóstico diferencial.
No Quadro abaixo são descritas lesões penianas que fazem parte do diagnóstico diferencial com as lesões causadas pelo HPV.

HPV e Biologia Molecular

A aplicação de métodos de biologia molecular para a identificação de agentes infecciosos vem apresentando rápida evolução nos últimos anos, devido, em grande parte, ao desenvolvimento de novas técnicas de análise do DNA e do RNA. A identificação dos agentes infecciosos é baseada na detecção do DNA ou RNA, que torna possível também a quantificação de bactérias, fungos e vírus num prazo de poucas horas e garante sensibilidade e especificidade elevadas. A lista de microorganismos que podem ser detectados por técnicas moleculares é crescente, assim como o são as alternativas metodológicas.
Na análise do DNA ou RNA, os métodos podem ser divididos genericamente em dois grandes grupos: os de amplificação do material nucléico (em sua maioria métodos de PCR e seus variantes) e os que utilizam amplificação de sinal (nos quais se enquadram os de hibridização, como a captura híbrida e hibridização “in situ”).

Tipos de testes de DNA

  1. Hibridização “in situ” sobre filtro é técnica simples e rápida, utiliza células esfoliadas frescas; o resultado é avaliado à vista desarmada; requer, assim, grande quantidade de células para um bom resultado e tendência a dar resultados falso-positivos;
  2. Hibridização “in situ”, muito diferente da técnica anterior, utiliza fragmentos de tecidos parafinados ou esfregaços celulares fixados em lâmina; o resultado é analisado em microscópio. Lancaster & Jenson (1987) acreditavam que se tornaria o método mais utilizado;
  3. PCR (Reação de Polimerase em Cadeia) foi desenvolvida por Mullins (1983) e provocou grande impacto, pois a sua grande sensibilidade permite a amplificação a partir de amostras muito escassas de DNA ou RNA; no entanto essa característica torna o método susceptível à contaminação por material nucleico exógeno ou amplificado de outra amostra (Troffatter, 1997), não sendo aprovado pelo FDA ( American Food Administration) para uso comercial;
  4. Captura híbrida foi desenvolvido em 1992, por Lörincz, a partir de estudos realizados desde 1983 sobre os métodos já existentes. Amplifica o sinal dos híbridos formados, os quais são detectados por reação enzima-substrato, e sua leitura é feita por quimioluminescência. É teste fácil de ser realizado, em curto espaço de tempo, aprovado pelo FDA e pelo Ministério da Saúde para uso comercial. Possui 18 sondas virais e pode detectar dois grupos distintos: grupo A, de baixo risco (6, 11, 42, 43, 44),e grupo B, de alto risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68). Sua sensibilidade é de 0,1 cópia de agente por célula.

O Quadro abaixo modificado por TROFFATTER (1997), mostram, respectivamente, as características dos métodos convencionais e as dos testes de DNA para a detecção de infecção de HIV.

QUADRO III –  CARACTERÍSTICAS DOS TESTES DE DNA PARA DETECÇÃO DA INFECÇÃO POR HPV

TESTE

SENSIBILIDADE

ESPECIFICIDADE

FACILIDADE
PARA
O TESTE

COMENTÁRIOS

Southern Blot

Alta

Alta

Fraca

Excelente para pesquisa e controle de
qualidade, porém muito demorado
e de difícil uso na clínica diária

Dot Blot

Moderada

Alta

Boa

Rápido e relativamente barato

Hibridização in situ

Moderada

Alta

Boa

Localiza DNA do HPV em tecidos

Hibridização
in situ com filtro

Fraca

Fraca

Boa

Simples execução, porém pouco preciso

PCR

Muito alta

Alta

Boa

PCR Procedimento "Real Time" Sistema fechado com proteção bioquímica de UDG = "Gold Standard" = Sensibilidade + Especificidade + Exatidão

Captura híbrida

Alta

Alta

Boa

Rápido e pode ser usado na clínica diária

HPV, E6, E7 e Câncer

Atualmente podemos detectar por biologia molecular as proteínas E6 e E7 produzidas pelo HPV que pode alterar o comportamento das células do colo do útero por interagir com o gene P53 e a Proteína do Retinoblastoma.
Podemos encontrar essas proteínas E6 e E7 em 1/3 das mulheres com HPV.
O exame consiste na coleta de material do colo uterino semelhante à técnica de papanicolaou sendo que no papanicolaou é avaliada as características das céluas colhidas, e no tesete de detecção do E6 e E7 é avaliada a presença das proteínas E6 e E7 por biologia molecular.

HPV, Histologia e o Patologista

O diagnóstico da infecção pelo HPV caracteriza-se pela presença de coilocitose (aspecto esburacado de uma célula devido à presença de grandes vacúolos perinucleares), disceratose (ceratinização imperfeita de células epidérmicas isoladas) e discariose (anomalias nucleares, especialmente aumento, hipercromatismo, irregularidades da forma do núcleo e aumento do número de núcleos por célula, sem aumento apreciável do citoplasma ou do contorno celular).
O estudo histológico, além de identificar as alterações histológicas sugestivas de infecção por HPV, possibilita diagnosticar outras lesões que podem vir associadas ou isoladas ao HPV, que fazem parte do diagnóstico diferencial.

Quando analisamos os resultados encontrados na histologia e biologia molecular de uma mesma biópsia observamos que na grande maioria dos estudos os resultados revelam um elevado número de casos com “Alterações sugestivas de infecção pelo HPV” na Histologia , enquanto que uma porcentagem menor confirma o DNA do HPV por algum método de Biologia Molecular (PCR, Hibridização in Situ ou Captura Híbrida).
Acredito que é muito importante a padronização da avaliação histológica para que os resultados encontrados com a Histologia cheguem próximos ao da Biologia Molecular, uma vez que nos serviços públicos e Hospitais Universitários não dispomos dos métodos de Biologia Molecular como rotina.
Atualmente considera-se como característica histológica típica do HPV a “coilocitóse e a discariose”.
Coilocitose significa célula abaulada , vacuolizada com núcleos localizados na periferia da célula.
Discariose significa alteração nuclear como núcleo disforme, dividido em 2 ou partes.
É prudente que todo especialista que atue com esse tipo de infecção tenha contatos constantes com os profissionais da área de Patologia, pois a toca de informações permite melhores resultados.

A Histologia além de evidenciar alterações indiretas da presença do HPV permite Diagnóstico Diferencial com outras doenças.
O ideal é a realização de Biópsia com exame Histológico e pesquisa do DNA do HPV no mesmo material colhido.
Alguns testes são mais sensíveis e específicos que outros, por isso a importância de associá-los.
A sensibilidade de um método consiste na identificação dos pacientes possivelmente infectados. Quanto mais sensível for o método, maior a possibilidade de definir se tem infecção.

A especificidade de um método permite distinguir entre os pacientes suspeitos e aqueles que não tem infecção.
Por exemplo, a Peniscopia tem alta sensibilidade ( encontramos muitos casos suspeitos, porém não são todos que tem a infecção), e os métodos de Biologia Molecular tem alta especificidade ( permite saber quem tem ou não o DNA do HPV).
Atualmente a melhor maneira de avaliar um Homem com suspeita de HPV é realizando uma peniscopia pois permite identificar as lesões suspeitas e coleta de material através da Biópsia Peniana e encaminhar este material colhido para Histologia e Biologia Molecular.
Obs: Nos locais em que os métodos de Biololgia Molecular não estão disponíveis o profissional deve ter um contato mais próximo com o Patologista para evitar laudos inespecíficos sugerindo infecção pelo HPV e aumentem os resultados falsos positivos.